一、介绍

视网膜电图（ERG）是一种用于测量视网膜外层在光刺激下产生电活动的电生理学工具。通过ERG测量，可以轻易地检测到视网膜各层面发生的功能缺陷。此外，ERG反应波形的特征有助于指向可能造成功能缺陷的视网膜细胞类型。因此，该方法特别适用于对经过基因或药物处理的动物进行视网膜功能的快速评估。

典型的ERG波形可细分为三个组成部分：一个由光感受器活动产生的小的初始a波，一个主要反映ON双极细胞去极化的大而正的b波，以及在光刺激结束时出现的d波。

在此，我们介绍一种用于对斑马鱼幼体（受精后4-7天）进行ERG测量的无创性方案。我们将一个细胞外记录电极置于幼体的角膜表面，并使用特定强度和持续时间的闪光来诱发反应。在典型的幼体ERG记录中，我们可以记录到ERG的a波、b波和d波。

二、材料

注意事项与配方：请参阅附录，了解对标记有的材料的适当处理方法，以及标记有的试剂的配方。

01.试剂

E3培养基

Esmeron/Zemuron (Organon/Schering Plough) (0.8 mg/mL in E3 medium)

斑马鱼幼体 (Danio rerio)

02.设备

电生理放大器

我们使用定制的AMPI放大器；然而，任何市售的电生理放大器均可接受。

刷子

数据采集卡 (NI PCI 6035E) 连接到BNC终端模块 (NI BNC-2090)

法拉第笼

光导 (例如，覆盖可见光谱的卤素灯泡)

光源 (24-V, 250-W投影灯) (例如，Liesegang Diafant 250)

Master-8刺激器

机械快门 (定制或商用)

显微操纵器 (例如，M3301; WPI)

微量移液器夹持器 (WPI)

微量移液器拉制仪 (例如，P-87)

显微镜 (双筒，含配备红外滤光片的光源)

中性密度滤光轮 (两个滤光轮，覆盖五个对数单位)

使用光度计 (Tekronix J17) 测量，幼体头部上方的未衰减光强为3100勒克斯 (光密度[OD]等于0对数单位)。

示波器 (例如，HM408) 或计算机及定制记录软件

培养皿(直径35毫米)

前置放大器 (通用交流型) (例如，P55)

记录电极 (硼硅酸盐玻璃微量移液器) (例如，300016)，尖端直径为15-30微米

参考电极(银/氯化银丸) (例如，HLA-003)

海绵或其他吸水性材料 (直径35毫米，以适配培养皿)

刺激器 (通用型) (Master-8；A.M.P.I.)

注射器

组织

三、方法

01.记录装置组装

完整的记录装置如图1所示。记录应在法拉第笼内进行，以减少电噪声干扰。

1. 将光源连接到光导、中性密度滤光轮以及机械快门。

中性密度滤光轮用于调节所需的光强度。快门由基于计算机的软件 (Master-8软件；A.M.P.I.) 控制。

2. 将记录电极和参考电极通过前置放大器连接到放大器。

记录电极的制备方法见步骤5。

3. 将放大器连接到示波器和数据采集板。

4. 设置一台用于定位幼体的双筒显微镜。

02.电极制备

5. 使用微量移液器拉制仪制备具有所需尖端直径（15-30 µm）的记录电极（微量移液器）。

使用P-87型拉制仪时，我们采用以下参数：热值 = 367，拉力 = /，速度 = 16，时间 = 250，压力 = 500。然而，这些参数会因所使用的拉制仪（和灯丝）类型而有很大差异。

确保尖端直径正确，且尖端平滑无损伤。尖端无需进行火焰抛光。

6. 用注射器向微量移液器内灌注E3培养基，并将其连接到微量移液器夹持器上。

7. 将微量移液器夹持器连接到显微操纵器上。

8. 在直径35毫米的培养皿中放入一块海绵或其他吸水性材料（直径35毫米）。将参考电极固定在这个装有海绵的培养皿中。将参考电极的丸状物置于双筒显微镜视野的中心。

9. 在参考电极上放置一小块组织。

10. 用E3培养基浸湿海绵和组织。

03.放置幼鱼

为最大限度地减少视色素的光漂白，所有操作均应在红光照明下进行。

11. 将斑马鱼幼体暗适应至少30分钟。用刷子将一条幼体放置在参考电极的丸状电极上。调整幼体方向，使其一只眼睛正对光束。

12. 滴加一滴爱可松溶液，使幼体肌肉麻痹。

13. 使用显微操纵器将记录电极定位于角膜中心。

记录电极应仅轻微接触眼睛表面；切勿将电极插入眼内。

14. 调整光导位置，使光束对准幼体头部。

04.标准测量记录

ERG波形示例如图2所示。

15. 开启所有实验设备组件。

16. 使用中性密度滤光轮调整所需光强度。

进行标准记录时，关闭所有外部光源（包括红外光）。如有需要，也可在不同背景照明水平下进行记录。

17. 进行标准测量时，根据刺激持续时间，使用100-1000毫秒的刺激时长和1000-2000毫秒的采集时间。

100毫秒的刺激足以诱发a波和b波；记录d波则需要较长的刺激持续时间（1000毫秒）。

所有记录均采用1000赫兹的扫描频率和1-100赫兹的带通滤波。

放大器与前置放大器的总信号放大倍数为1000倍。

18. 在示波器上观察记录波形，或使用计算机及定制记录软件（如LabVIEW VI）进行记录。

参见"疑难解答"部分。

19. 为生成平均曲线，重复测量五次，刺激间隔设定为5000-7000毫秒（图2）。

刺激间隔可根据需要调整；若在不同光强度下进行记录，可延长间隔时间为转动滤光轮留出时间。

图2. 野生型斑马鱼（受精后5天）的典型ERG波形（刺激时长1秒，采集时间2秒）。所展示波形为对同一幼体（光照强度6000勒克斯）进行的五次测量（作为标准操作）的平均曲线。

四、故障排除

问题：在没有样品的情况下出现可测量的电信号。

[步骤 10]

解决方案：这是由于参考电极氧化导致的光伏效应。检查参考电极是否呈现明亮金属光泽。如非，请使用细砂纸小心清洁。此操作应能消除光电响应。

深圳市富临神通科技有限公司（原“东莞市富临塑胶原料有限公司”）是 AMPI中国代理商，我们为客户提供Master-8、Master-9等电刺激产品。

问题：观察到不规则波形（例如，多个波峰）。

[步骤 18]

解决方案：记录电极可能存在缺陷，例如尖端不平滑或尖端过细。更换记录电极。

问题：即使在强光下，观察到的b波振幅也偏小（<150 µV）。

[步骤 18]

解决方案：检查记录电极是否正确定位于角膜中心，并移除海绵上多余的E3培养基。或者，更换记录电极。

问题：高背景噪声影响测量。

[步骤 18]

解决方案：请考虑以下方面：

• 确保实验装置的所有组件均已正确接地。在初始设置阶段可能需要对此进行调整。

• 在整个装置前放置金属网格以降低噪声（图1）。

• 在放大器上使用50赫兹滤波器。

• 开口直径过小的记录电极也会产生电噪声；请使用尖端直径至少为15 µm的电极。

图1. （A）ERG装置示意图，包含相关技术组件。（B）斑马鱼幼体在装置中放置的特写图片；插图显示记录电极在幼体角膜上的定位情况。

五、讨论

本文所述的ERG装置可用于测量斑马鱼幼体、青鳉鱼幼体以及非洲爪蟾蝌蚪的ERG反应。此外，该装置稍加调整后也可用于成年斑马鱼（需配合使用充氧腔）及其他水生物种的测量。

斑马鱼幼体在受精后第4天（4 dpf）开始表现出可靠的ERG反应。需要注意的是，此阶段幼体测得的反应均为视锥细胞驱动，因为视杆细胞在15 dpf前对ERG反应无贡献。因此，该发育阶段的幼体视网膜在功能上被视为以视锥细胞为主导。

使用专用记录软件（如LabVIEW虚拟仪器）可创建不同的实验范式（如光漂白、双闪光范式等），这对于探讨特定的生物学问题具有重要价值。

深圳市富临神通科技有限公司（原“东莞市富临塑胶原料有限公司”）是 AMPI中国代理商，采购Master-8、Master-9等电刺激产品请立即联系我们。